Ras超家族亚群A/Rho关联含卷曲螺旋结合蛋白激酶1在无机磷酸盐中诱导大鼠瓣膜间质细胞成骨分化的作用机制

更新时间:2023-05-28

【摘要】目的 探讨Ras超家族亚群A(RhoA)/Rho关联含卷曲螺旋结合蛋白激酶1(Rock-1)在无机磷酸盐中诱导大鼠瓣膜间质细胞(VICs)成骨分化的作用机制。方法 取8只雄性大鼠(购自上海西普尔必凯动物实验有限公司)的主动脉瓣膜消化培养至第3代后免疫荧光鉴定。小干扰RNA(siRNA)-RhoA转染VICs后用无机磷酸盐成骨培养基(IP-OIM)分别诱导转染组(RNAi),阴性对照组(NC)及空白对照组(CON)的成骨分化,并通过蛋白质印迹法(Western blot)与聚合酶链反应(PCR)评估转染后RhoA、Rock-1、Runt相关转录因子2(Runx-2)及骨钙素(OST)的变化；7 d行碱性磷酸酶(ALP)活性相关检测,14 d行钙含量相关检测评估其早期与晚期成骨分化趋势。用IP-OIM刺激转染后的VICs 60 min,并通过Western blot检测SMAD1/5/9的磷酸化变化。采用单因素方差分析。结果 鉴定后的VICs转染siRNA-RhoA并用IP-OIM培养,经过Western blot及PCR检测后可知RNAi的RhoA(Western blot：0.330±0.020；PCR：0.357±0.060)及Rock-1(Western blot：0.366±0.020；PCR：0.383±0.040)比CON均出现表达下调(RhoA Western blot：t＝36.680,P<0.05 PCR：t＝10.610,P<0.05；Rock-1 Western blot：t＝31.240,P<0.05 PCR：t＝13.210,P<0.05),差异有统计学意义,RNAi的OST(Western blot：0.520±0.030；PCR：0.510±0.070)和Runx-2(Western blot：0.573±0.020；PCR：0.57±0.060)比CON也出现了下降(OST Western blot：t＝16.630,P<0.05；PCR：t＝6.970,P<0.05；Runx-2 Western blot：t＝21.040,P<0.05；PCR：t＝6.710,P<0.05),差异有统计学意义。在7 d的ALP染色中RNAi的颜色最浅,ALP活性检测中RNAi [(1.005±0.101) U/mg]活性比较NC[(2.042±0.116) U/mg]和CON[(1.931±0.136) U/mg]明显下降(t＝10.570,P<0.05；t＝9.400,P<0.05),差异有统计学意义。在14 d的相对钙含量测定中RNAi[(22.290±1.981) ng/L]钙含量比较NC[(41.100±2.440) ng/L]和CON[(41.760±1.215) ng/L]明显下降(t＝10.530,P<0.05；t＝14.510,P<0.05),差异有统计学意义；同样茜素红钙沉积染色中,也是RNAi颜色最浅。经IP-OIM分别刺激60 min,RNAi的SMAD1/5/9的磷酸化水平(0.337±0.030)比CON明显下降(t＝25.480,P<0.05),差异有统计学意义。结论 无机磷酸盐可通过RhoA/Rock-1引起瓣膜间质细胞的成骨分化,SMAD1/5/9的磷酸化在此过程中起重要作用。

【关键词】 瓣膜间质细胞 钙化性心脏瓣膜病 无机磷酸盐 Ras超家族亚群A/Rho关联含卷曲螺旋结合蛋白激酶1 SMAD1/5/9

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